ТҚҰ туберкулез ауруын культуральдық әдістермен анықтау тәртібі

1. Диагностикалық материалды культуральдық зерттеу жұмыртқа қосылған Левенштейн-Йенсен қатты қоректік ортасында жүргізіледі.
2. Диагностикалық материалдарды өңдеуге арналған ерітінділерді дайындауға қажетті барлық реактивтердің тазарту дәрежесі «химиялық таза» (ХТ) санатына сәйкес болуы тиіс.
3. Зертханаға келіп түскен материал зерттеу жүргізбес бұрын зертханалық тіркеу журналында тіркеледі. Зерттеудің барлық түрлерін жүргізу үшін әрбір үлгіге бір ғана зертханалық тіркеу нөмірі беріледі.
4. Қоректік ортаға себу алдында диагностикалық материалды деконтаминациялау (залалсыздандыру) үшін арнайы өңдеуден өткізеді.
5. Биологиялық сұйықтықтар мен тіндерді стерильді флакондарға асептика ережелерін сақтай отырып алған болса, деконтаминация жүргізу қажет емес: жұлын, синовиальді және басқа да жабық қуыстардан алынған сұйықтықтар; сүйек майы; «суық» абсцесстерден алынған ірің; резекцияланған тіндер (аутопсия материалынан басқа); бауыр мен лимфа бездерінен алынған пунктаттар және биопсия материалдары (жыланкөз болмаған жағдайда).
Қақырық деконтаминациясы екі әдіспен жүргізіледі:
1) қақырықты NaOH сілті ерітіндісімен өңдеу, натрий цитратының 2,9% ерітіндісі мен NALC ерітіндісін бірдей көлемде қосып. Деконтаминация емшарасы ВАСТЕС-ті өндірушінің нұсқауына сәйкес жүргізіледі. Содан кейін түтіктерді суытатын қызметі бар центрифугаға салып, 3000-3500g жылдамдықта 20 минут бойы центрифугалайды. Содан кейін түтіктерді аэрозолі шөгу үшін 5 минутке II классты қауіпсіздік шкафына салып қояды. Тұнбаның бетіндегі сұйықтықты (супернатант) залалсыздандыратын ерітіндісі бар ыдысқа абайлап құйып алады да, тұнбаға стерильді пастер тамызғышымен 0,8-1,0 мл стерильді фосфат буферін қосады. Тұнбаны тамызғыштың көмегімен ақырындап араластырады да (қатты араластыруға болмайды), қоректік ортаға себеді;
2) материалды бекітілген стандарттарға сәйкес күйдіргіш натрдың 4% ерітіндісімен өңдеу (модификацияланған Петров әдісі).
7. ТМБ қатты қоректік ортада 8 апта бойы инкубациялайды.
8. Диагностикалық материалды қоректік ортаға себудің нәтижелерін бағалау:
1) келесі белгілер тіркеледі: өсіндінің пайда болуы – өсу мерзімі, өсу қарқыны – колониялар саны; себіндінің басқа микрофлорамен немесе саңырауқұлақтармен ластануы; өсудің болмауы;
2) апта сайын тексеру барысында ластанған түтіктерді (өсім) алып, автоклавта немесе өртеу арқылы жояды.
9. Диагностикалық материалды қоректік ортаға себудің нәтижелерін есепке алу.
Себудің оң нәтижесі дәлелденеді:
қатты қоректік ортада кем дегенде 3-4 апта бойы инкубациялағаннан кейін колониялардың өсуімен;
өзіне тән морфологиясы және түсі бар колониялардың болуымен;
өсіндіден Циль-Нильсен әдісі бойынша жасалған жағынды микроскопиясы кезінде қышқылға төзімді микроорганизмдердің анықталуымен.
Өсу қарқынын 4 баллдық жүйе бойынша бағалайды:



Колониялар саны Градация дәрежесі
1-ден 19-ға дейін Колониялардың нақты санын көрсету
20-дан 100-ге дейін 1+
100-200 2+
200-500 3+
500-ден астам 4+

Өсіп шыққан микобактериялардың жоғарыда аталған барлық сипаттамалары зертханалық культуральдық зерттеу нәтижелерін тіркеу журналына, жауап бланкісіне, сонымен қатар жеке есепке алудың компьютерлік дерекқорына жазылады.

М. tuberculosis сәйкестендіруідің негізгі биохимиялық тесттері

10. Өсіп шыққан микобактериялардың М. tuberculosis кешеніне жататынын арнайы зертханалық тесттер негізінде міндетті түрде дәлелдеу қажет.
11. М. tuberculosis кешені микобактерияларын туберкулезді емес микобактериялардан бастапқы идентификациялау келесі культуральдық белгілер бойынша жүргізіледі: қатты қоректік орталарда өсу жылдамдығы; пигмент түзу; колониялардың морфологиясы; қышқылға төзімділіктің болуы; өсу температурасы. М. tuberculosis кешеніне микобактериялардың келесі түрлері жатады: М. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. Microti. Оларды баяу өсетін қышқылға төзімді туберкулезді емес микобактериялардын ажырату үшін келесі негізгі биохимиялық тесттер қолданылады: никотин қышқылын бөлу мүмкіндігін анықтайтын тест (ниацинды тест); нитратредуктазды белсенділіктің болуын анықтайтын тест; термотұрақты каталазаның болуын анықтайтын тест; салицил қышқылды натрийі (1 мг/мл) бар ортада өсу тестті (немесе паранитробензой қышқылының 500 мкг/мл мөлшері бар ортада өсу тестті; 5% натрий хлориді бар ортада өсу тестті).
12. М. tuberculosis және М. bovis ажырату үшін келесі сынамалардың нәтижелері есепке алынады: ниацинды тест; нитратредуктазаның бар болуын анықтайтын тест; пиразинамидазаның бар болуын анықтайтын тест; молекулалы-генетикалық зерттеумен түрін анықтау (Geno Type MTB® DR).



ТМБ ТҚП сезімталдық тестін қатты қоректік орталарда анықтау

13. ТМБ туберкулезге қарсы қолданылатын бірінші және екінші қатардағы дәрілерге сезімталдығын Левенштейн-Йенсен (бұдан әрі – Л-Й) қоректік ортасында пропорция әдісімен анықтайды.
14. ДСТ пропорция әдісімен анықтау үшін Л-Й ортасы қолданылады, тест жүргізіліп отырған штаммдардың төзімділігі дәрілері бар ортада өсіп шыққан колониялар санының дәрілері жоқ ортада өсіп шыққан колониялар санына қатынасы ретінде есептеледі. Бұл көрсеткіш тіршілікке қабілетті колония түзетін бірліктердердің (бұдан әрі - КТБ) жалпы популяциясындағы төзімді мутанттар пайызын анықтауға мүмкіндік береді.
15. ДСТ қатты қоректік ортада пропорция әдісімен бекітілген стандарттарға сәйкес жасалады.
16. Л-Й ортасындағы дәрілік заттардың сыни концентрациялары:
Изониазид - 0,2 мкг/мл; Стрептомицин - 4,0 мкг/мл; Рифампицин - 40 мкг/мл; Этамбутол - 2,0 мкг/мл; Офлоксацин - 2 мкг/мл; Амикацин - 20 мкг/мл; Капреомицин - 20мкг/мл; Этионамид - 20 мкг/мл; Циклосерин - 20 мкг/мл; ПАСК - 1,0 мкг/мл; Канамицин - 20 мкг/мл.
17. Дәрілері бар қоректік ортаны дайындау барысында өндірушіге сәйкес дәрілердің бір партиясынан/сериясынан келесісіне өзгеріп отыруы мүмкін дәрілердің белсендігін ескеру қажет. Бұл мәліметтер контейнерлердің сыртындағы заттаңбада, орауышында жазылуы мүмкін немесе өндірушінің өзі хабардар етеді.
18. Түтіктерді термостатта еңкейтіп, қақпағын тығыздап жаппай, 370 C температурада дәрісіз қоректік ортада көзге көрінетін өсінді пайда болғанға дейін, содан кейін 4-6 апта бойы ауызын бітеп сақтайды.
19. Нәтижесін бағалау. Төзімділіктің болуына нұсқайтын белгі – барлық дәрілер үшін бактериальды популяцияның 1,0% өсуі. 4 апта бойы инкубациядан кейін дәрісі жоқ ортадағы 10-4 суспензиядан егілген өсу қарқынын дәрісі бар ортадағы 10-2 суспензиядан егілген өсу қарқынымен салыстырады. Егер дәрісі бар ортадағы колониялар саны көбірек болса (1% тең немесе артық), тест жүргізілп отырған штамм төзімді болып саналады.

ТҚҰ зертханаларында автоматтандырылған BАСТЕС MGIT-960 жүйесінде сұйық қоректік орталарды қолдана отырып туберкулез ауруын культуральдық әдістермен анықтау тәртібі

1. Туберкулез ауруын сұйық қоректік орталарда культуральдық әдіспен автоматтандырылған BАСТЕС MGIT-960 жүйесін қолдана отырып анықтайды. ТМБ өскен жағдайда (1 мл ортада 105-106 КТБ дейін) аспап сынаманы оң нәтижелі деп бағалап, жарықпен немесе дыбыспен белгі береді. 6 апта (42 күн) бойы өсу байқалмаса, аспап сынаманы теріс нәтижелі деп бағалайды.
2. Сұйық қоректік орталардағы культуральдық әдіс емшарасы бекітілген стандарттарға сәйкес жүргізіледі.
3. Сұйық қоректік орталарға себу II классты қорғанысты ламинарлы боксте жүргізіледі. Түтіктерді жұмыс алдында таңбалайды, таңба жазуы түтіктердің штрих-кодына түспеуін ерекше қадағалау қажет.
4. Теріс нәтижелі түтіктердегі қоректік орталарда өзгеріс байқалса, одан жағынды жасап, микроскопиялық зерттейді және материалды қанды агар (ластануды бақылау үшін) мен Левенштейн-Йенсен ортасына себеді.
5. Оң нәтижені дәлелдеу мақсатында әр MGIT түтігінен жағынды жасап, оларды жалпы нұсқауға сәйкес Циль-Нильсен әдісімен бояйды. Қышқылға төзімді «бұрым» тәрізді колониялар туберкулез микобактерияларының бар екендігіне нұсқайды. Жеке орналасқан қышқылға төзімді бактерия жасушалары анықталса, өсіндіні идентификациялау қажет.
6. Егер аспап оң нәтижелі деп бағалаған түтіктен жасалған жағынды микроскопиясы теріс нәтижелі болса, ал қоректік ортаның өзі мөлдір болса және оның ластанғанына күдік болмаса, түтікті жүйеге тағы қосымша 3 күнге салып қояды. Содан кейін жағынды микроскопиясын қайталайды. Қайтадан жасалған микроскопия теріс нәтижелі болса, ортаны көзбен қарап тексергенде өсудің және ластанудың белгілері болмаса (қанды агарда өсу байқалмаса), сонымен қатар Л-Й ортасында 10 апта бойы өсу белгілері болмаса, сынама теріс нәтижелі болып саналады.
7. Ластанудың мүмкін деңгейі қатты қоректік орталар үшін 3-5%, сұйық қоректік орталар үшін – 7-8%.
8. Микобактериялар түрін ажыртау үшін келесі белгілер қолданылады:
1) өсу қарқыны: M.tuberculosis, M. bovis және белгілі дәрежеде M.kansasii туберкулезді емес микобактериялармен салыстырғанда баяу өседі;
2) сұйық ортада өскен жағдайда ТМБ түйіршік тәріздес болады, туберкулезді емес микобактериялардың көбі ортаны біртегіс аздап лайландырады (M. Kansasii-ден басқалары);
3) оң нәтижелі MGIТ ортасынан жасалған жағындыда туберкулезді микобактериялар кешені/жиынтығы айқын ұйысулар мен жылан тәріздес жіптер (корд-фактор) түзеді, ал туберкулезді емес бактериялар жеке-жеке кішігірім ұйысулар мен жіптер немесе бірен-саран жасушалар түзеді.
9. ДСТ қою:
1) ТМБ туберкулезге қарсы қолданылатын бірінші және екінші қатардағы дәрілерге сезімталдығын BАСТЕС MGIT – 960 аспабында пропорция әдісі негізінде анықтайды. ДСТ үшін қатты қоректік орталармен салыстарғанда ТҚП таза субстанцияларының төмендеу шоғырлануын қолданады (сезімталдықтың жалған нәтижесінен сақтану үшін): стрептомицин – 1,0 мкг/мл; изониазид – 0,1 мкг/мл; рифампицин – 1,0 мкг/мл; этамбутол – 5,0 мкг/мл;
2) ДСТ BАСТЕС MGIT-960 үшін бекітілген нұсқауларға сәйкес жасалады;
3) себінді жасалған түтіктер дәріге сезімталдықты анықтауға арналған арнайы ұстағыштарға қатаң тәртіппен қойылады: бақылау, стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол.
10. Нәтижелерді есепке алу: тест аяқталған соң (14-21 күн ішінде) аспапта нәтиженің дайын болғану туралы қабарлама пайда болады. Оларды алу үшін ұстағыштағы штрих-кодты сканирлеп, есепті басып шығарады, онда әрбір дәрілік заттың ДСТ жазылады: сезімтал (S); резистентті (R), тест нәтижесі анықталған жоқ немесе қате жіберілді (X).
Аспап бақылаудағы өсу бірліктерінің (GU) мөлшері 400 жеткенде (4-13 күн ішінде) нәтижелерін оқи бастайды. Дәрісі бар түтіктегі өсу көрсеткіштерін бағалау:
S – дәрісі бар түтіктегі өсу бірлігі 100 кем емес;
R – дәрісі бар түтіктегі өсу бірлігі 100-ге тең және одан артық;
Х – тест емшарасына әсер ететін кейбір жағдайларда байқалатын түсініксіз нәтижелер (мысалы, бақылау үлгісіндегі өсу бірлігі 4 күннен аз уақытта > 400). Бұндай жағдайда тестті M. tuberculosis жиынтығы деп дәлелденген, таза, белсенді өсіп жатқан өсіндімен қайталау керек.
Кейбір дәріге төзімді штаммдар қоректік ортада өте баяу өседі де, стандартты егу барысында 13 күн ішінде нәтиже алу мүмкін болмайды. Бұндай жағдайда зерттеуді қайталау қажет.
Есеп беру: дәріге сезімталдықты зерттеу нәтижелері дайын болған бетте бірден клиникалық бөлімшелерге жіберіледі. Нәтиже қолданылған әдісті, дәрі түрін және оның шоғырлануын көрсете отырып, «сезімтал» немесе «резистентті» деп белгіленеді.
11. Пиразинамидке сезімталдық тесттілері:
1) пиразинамидке ДСТ анықтауда ортадағы рН деңгейін сақтауға ерекше талап қойылады (in vitro пиразинамид тек қышқыл ортада ғана белсенді) және BАСТЕС MGIT - 960 аспабы үшін ортаның рН көрсеткіші 6,0 аспайтын тест әзірленген; рН мөлшерінің орнын толтыру үшін пиразинамидтің концентрациясы 100 мкг/ мл дейін көбейтілген;
2) BАСТЕС MGIT-960 аспабындағы пиразинамидке ДСТ бекітілген стандарттарға сәйкес жүргізіледі.
12. Екінші қатардағы дәрілерге ДСТ.
Екінші қатардағы дәрілерге ДСТ анықтауға арналған дайын жиынтықтар жоқ.
Реагенттер: екінші қатардағы ТҚП субстанцияларының сыни шоғырланулары есептеледі. Дистилденген сумен немесе арнайы еріткішпен ерітілген дәрілерді автоматты тамызғының көмегімен 0,1мл-ден (100 мкл) таңбаланған MGIT түтіктеріне құйылады. ДСТ арналған өсіндіні дайындау және тесттің өзі жоғарыда сипатталған бірінші қатардағы ТҚП сезімталдықты анықтау емшарасымен бара-бар жасалады.
Екінші қатардағы ТҚП шоғырланулары: амикацин – 1,0 мкг/мл; капреомицин – 2,5 мкг/мл; офлоксацин – 2,0 мкг/мл; этионамид – 5,0 мкг/мл.
Есептеу кезінде 1 г субстанциядағы белсенді заттың мөлшері ескеріледі:
1) офлоксацин мен этионамидті бірінші рет диметилсульфоксидпен (DMSO) ерітеді.
2) сақтауға арналған дәрілерді кем дегенде 0,5 мл (3-4 ДСТ) мөлшерде алу керек, өйткені сақтау барысында олардың шығыны болады.

Туберкулез ауруын және дәріге сезімталдықты анықтаудың молекулалы-генетикалық әдістерін (Geno Type ®MTBDR, Xpert MTB/RIF) қолдану тәртібі

1. Рифампицинге төзімділік РНК белсенділігіне жауапты жалғыз rpoB генінде кодталған, изониазидке төзімділік бірден төрт гендегі мутациялармен бақыланады – katG, inhA, ahpC және oxyR, GenoType ® MTBDR plus-тест жиынтығы қолданылады.
2. Рифампицинге төзімділікті анықтау rpoB (РНК полимеразаның бета-суббірлігінің кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анықтауға негізделген. Изониазидке жоғары деңгейдегі төзімділік katG (каталаза-пероксидазаның бөлінуінің кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анықтауға негізделген болса, бұл дәріге төзімділіктің төменгі деңгейі inhA (NADH-Enoyl-АТФ-редуктазаның кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анықтауға негізделген.
3. GenoType ® MTBDR sl-тест жиынтығы 2 күн ішінде ТМБ аминогликозидтер мен фторхинолондарға төзімділікке жауапты гендеріндегі мутацияларды анықтауға мүмкіндік береді, яғни бактериаологиялық анализдердің нәтижесі дайын болғанға дейін көп бұрын науқастарда ДАТ ТБ бар екендігін анықтауға мүмкіндік береді.

Гендік-молекулалық Xpert MTB/RIF технологиясы

4. Xpert MTB/RIF – нақты уақытта полимерлі тізбекті реакцияны (ПТР) іске асыратын толық автоматтандырылған жүйе, соның нәтижесінде 2 сағат ішінде ТМБ жиынтығының ДНК детекциясы мен рифампицинге төзімділікке жауапты rpoB геніндегі мутациялар бірдей анықталады.
5. GeneXpert жүйесіне компьютер, штрих-кодты оқитын сканер және құрамында зерттеу жүргізуге қажетті реагенті бар бір рет қолданылатын картридждер кіреді.
6. Зерттеуге болатын материалдар: қақырық, БАС, жұлын сұйықтығы, лимфа бездері немесе басқа тіндер.
7. Зерттеуге қажетті қақырық мөлшері – 3-5 мл. Әрбір үлгі дұрыс таңбалануы тиіс, кем дегенде әмбебап сәйкестендірме нөмірі жазылуы керек. Бұл нөмір сонымен қатар зерттеуге жолдамаға және зертханалық журналға тіркеледі. Үлгіде тағам қалдықтары немесе басқа да қатты қоспалар болмауы тиіс.
8. Xpert MTB/RIF-ке қажетті картридждер мен реагенттер 2–280C температурада сақталуы тиіс. Картридждердің орамасын ашқаннан кейін 7 күн ішінде өзінің тұрақты қасиеттерін сақтайды.
9. Реагенттер мен картридждердің жарамдық мерзімі өткен соң қолданылмайды.
10. Есепке алу, тіркеу және есеп беру. Нәтиже төмендегідей болып беріледі:
ТМБ анықталған жоқ (теріс нәтиже);
ТМБ анықталды, Rif resistance анықталған жоқ (оң нәтиже, рифампицинге сезімтал);
ТМБ анықталды, Rif resistance анықталды (оң нәтиже, рифампицинге төзімді);
ТМБ анықталды, Rif resistance анықталмады (оң нәтиже, рифампицинге төзімділікті анықтау мүмкін болмады, бұл микроб жасушасының гендік материалының жеткіліксіз болғанына нұсқайды).


3422449734770376.html
3422513735879410.html
    PR.RU™